پایان نامه تخصصی بررسی جهش های ژن

پایان نامه تخصصی بررسی جهش های ژن CFTR در مردان نابارور مبتلا به انواع مختلف آزوسپرمی انسدادی

پایان نامه تخصصی (دکترا) رشته ژنتیک مولکولی، چکیده فارسی: سیستیک فیبروزیس (CF) یکی از شایع ترین بیماریهای اتوزومال مغلوب در سفیدپوستان ،با بروز 1 در 2500 است ودر اثر نقص در ژن CFTR ایجاد می شود که این ژن، کد کننده پروتئینی است که به عنوان یک کانال کلرید در غشائ سلول های اپیتلیال، لوله های ...

چکیده فارسی:
سیستیک فیبروزیس (CF) یکی از شایع ترین بیماریهای اتوزومال مغلوب در سفیدپوستان ،با  بروز 1 در 2500 است ودر اثر نقص در  ژن CFTR  ایجاد می شود که این ژن، کد کننده پروتئینی است که به عنوان یک کانال کلرید در غشائ سلول های اپیتلیال، لوله های تنفسی، لوزالمعده، روده، غدد عرق و مجاری واز دفران واقع شده است. نقص در ژن CFTR باعث ایجاد غلظت غیر طبیعی کلرید در امتداد غشا سلول های اپیتلیال شده که منجر به بیماری ریوی پیشرونده،اختلال عملکرد پانکراس،افزایش کلریدعرق و ناباروری مردان می شود.در مطالعه حاضر فرکانس و ماهیت جهش ها و برخی از پلی مورفیسم ها ی ژن CFTR در مردان نابارور مبتلا به آزواسپرمی انسدادی ارزیابی شد.
در مجموع از 76 بیمار و 50 مرد بارور ،یک پانل از 5 جهش شایع در CFTR با استفاده از تکنیک PCR - ARMS غربالگری شد همچنین اگزونهای داغ از نظر جهش( 7،10،11،20،21،4) در ژن CFTR با استفاده از روش PCR - SSCP و در پی آن با توالی یابی غربالگری شدند. 18 بیماربا آزواسپرمی و CBAVD ، 53 بیمار مبتلا به آزواسپرمی بدون CAVD (Non-CAVD) و 5 بیمار مبتلا به آزواسپرمی و CUAVD بیماران مورد مطالعه مارا تشکیل می دادند. طول ناحیه پلی T (آللهای 5T،7T و 9T) واقع در splice-acceptor site اینترون 8/اگزون9 و پلی مورفیسم M470V واقع در اگزون 10 با استفاده از روش PCR-RFLP مشخص شد.
در 7 نفراز 18 بیمار مبتلا به CBAVD ، جهش CFTR یافت شد ، سه نفراز بیماران هرکدام دارای یک جهش ΔF508بودند. آلل5T  در سه نفر از این بیماران یافت شد. در یک بیمار ، آلل 5T با جهشی غیر ازΔF508 همراه بود. در بیماران با CUAVD فقط یک جهش CFTR مشاهده شد. جهش های شایع CFTR در 9 نفر از 53بیمارمبتلا به Non-CAVD ، یافت شد و پنج نفر ازاین بیماران دارای یک جهش ΔF508بودند. آلل5T  در پنج مورد از این بیماران یافت شد. در دو بیمار ، آللT5 با ΔF508 همراه نبود و در هشت بیمار حامل آلل 5T هیچیک از جهش های شایع یافت نشدند . در بیماران  مبتلا به  CBAVD ، Non-CAVD و CUAVD فراوانی آلل5Tبه ترتیب22 ٪ ،14 ٪ (معنی دار نسبت به گروه کنترل)و10 ٪ (غیر معنی دار نسبت به گروه کنترل) بدست آمد.
جهش آلل5Tبا طیف وسیعی از تظاهرات بالینی و فرکانس بالا در بیماران CBAVD مشاهده شد.
ژنوتیپ 5T/M470 به ترتیب در 3 ، 5 و 1 نفرو ژنوتیپ 5T/V470 . به ترتیب در 0،1 و  0 نفرو 5T همراه با فرم هتروزیگوت M470V به ترتیب در 5،8و0 نفراز بیماران CBAVD ، غیر CAVD و CUAVDیافت شد.
مشاهدات ما نشان داد که ژن CFTR در روند اسپرماتوژنز و یا در آسیب شناسی دستگاه تناسلی نقش دارد.
در بیماران بر خلاف گروه کنترل فرکانس آلل M470بالاتر از آللV470  بود واین نشان می دهد که آلل M470 با نقص پروتئین CFTRمرتبط است.
اگر مرد مبتلا به CBAVD ، Non-CAVD و CUAVD باشد حتی با وجود سابقه خانوادگی منفی. از نظر CF غربالگری جهش CFTR قبل از درمان ناباروری ضروری خواهد بود
کلمات کلیدی:جهش CFTR ، CBAVD ، آزواسپرمی انسدادی ، تکنیک PCR-ARMS-


فهرست مطالب:
چکیده فارسی         
فصل اول        
1-1 . مقدمه   
1- 2.  ناباروری         
1-2-1 . ناباروری در مردان     
1-2-1-1 . عوامل مؤثر در ناباروری مردان     
1-2-1-1-1. اختلالات ژنتیکی 
1-2-1-1-1-1.کروموزوم Y      
1-2-1-1-1-1-1. بازوی کوتاه کروموزوم Y  (YP)       
1-2-1-1-1-1-2. بازوی بلند کروموزوم Y (Yq)         
1-2-1-1-2. انواع ناهنجاری‌های اسپرمی در مردان نابارور  
1-2-1-1-2-1.انواع آزوسپرمی         
1-3 . ژن CFTR         
1-3-1 . ساختار پروتئین CFTR        
1-3-2 . عملکرد پروتئین CFTR        
1-3-3 . ارتباط جهش ژن CFTR وبیماری      
1-3-4 . ساختار ژن CFTR     
1-3-5.  ساختار mRNAای ژن CFTR 
1-4 . سیستیک فیبروزیس(فیبروز کیستیک)
1-5.  تشخیص پیش از تولد  
1-6.ضرورت انجام تحقیق      
1-7.اهداف تحقیق     
1-8.سؤالات و فرضیه ها       
فصل دوم       
2-1.تاریخچه ومروری بر مطالعات گذشته     
2-2. تاثیر پلی مورفیسم های ژن CFTR      
2-3.ارتباط جهش در ژن CFTRوآزواسپرمی  
فصل سوم      
3-1.نمونه گیری        
3-1-1.نمونه های خونی       
3-2.استخراج DNAاز نمونه های خون         
3-3.تعیین غلظت DNA        
3-3-1. مراحل انجام روش اسپکتروفتومتری 
3-3-2. بررسی کیفی DNA استخراج شده به روش الکتروفرز روی ژل آگارز        
3-4. واکنش های زنجیره ای پلی مرازی(PCR)       
3-4-1. مواد اولیه واکنش PCR         
3-4-2. سیکلهایPCR          
3-4-3.روش انجام PCR         
3-5.مواد و محلولهای مورد نیاز برای الکترو فورز ژل آگارز    
3-6.تهیه ژل آگارز5/1%        
3-7. الکتروفرز محصولات PCR بر روی ژل پلی اکریل آمید   
 3-7-1.مواد و محلول های مورد نیاز برای تهیه ژل پلی اکریل آمید 
3-7-2. تهیه ژل پلی اکریل 
3-7-3.PCR-RFLP      
3-7-4.تهیه ژل SSCP  
3-8. رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید به روش نیترات نقره    
3-8-1. مواد و محلول های مورد نیاز برای رنگ آمیزی نیترات نقره 
3-8-2.روش انجام رنگ آمیزی نیترات نقره    
3-9.انجام SSCP        
3-10.طراحی پرایمر   
3-11.نحوه آماده سازی پرایمرها      
3-12 PCR-RFLP.   
3-12-1.انجام PCR-RFLP    
3-13. ARMS-PCR..         
3-14.توالی یابیDNA(DNA Sequencing)   
3-15.مراحل خواندن توالی    
3-16.آنالیز آماری      
فصل چهارم    
کلیات  
4-1.بررسی و نگهداری نمونه های حاصل از استخراج DNAژنومی 
4-2. نتایج بررسی جهش های شایع ΔF508، G542X، N1303K و W1282X       
4-3. نتایج بررسی جهش شایع W1282X با استفاده از روشSingle ARMS PCR  
4-4. نتایج بررسی جهش R117H    
4-5. نتایج بررسی اگزون10 ژن  CFTRبا استفاده ازتکنیک SSCP – PCR   
4-6. نتایج بررسی اگزون21 با استفاده ازتکنیک PCR-SSCP        
4-7. نتایج بررسی پلی مورفیسم پلیT ژن CFTRبا استفاده ازتکنیک PCR-RFLP.، آنزیم Hpa1 و پرایمرهای CFT5،CF9RRو CFT7،CF9RR 
4-8.نتایج بررسی پلی مورفیسم M470V ژن CFTRبا استفاده ازتکنیک PCR-RFLP. و آنزیم Hph1 و پرایمرهای اگزون10        
فصل پنجم     
5-1.بحث وتفسیر      
5-2.نتیجه گیری نهائی        
5-3.پیشنهادها         
6. منابع          
چکیده انگلیسی    
فهرست اشکال:
 شکل 1-1. پروتئین CFTR    
شکل 1-2.فرد مبتلابه CFو شجره نامه مربوطه      
شکل2-1.مراحل لقاح خارج رحمی از نوع میکرو اینجکشن (ICSI) 
شکل 3-1. توالی ژن CFTR را نشان می دهد        
شکل 3-2. مرحله اول خواندن توالی          
شکل 3-3. مرحله دوم از خواندن توالی       
شکل 3-4. مرحله سوم خواندن توالی        
شکل3-5. .مرحله چهارم خواندن توالی      
شکل 3-6. .مرحله پنجم خواندن توالی       
شکل 3-7. .مرحله پایانی خواندن توالی     
شکل 1-4. .نتایج حاصل از استخراج DNA   
شکل 4-2. تعیین جهش های شایع ΔF508، G542X، N1303K     
شکل 4-3. تعیین جهش W1282X با استفاده از روش ARMS-PCR          
شکل 4-4. شناسایی جهش R117H با استفاده از روش PCR-RFLP .     
شکل 4-5-1. نمونه ای از ژل SSCP در مورد اگزون 10 ژن CFTR    
شکل4-5-2.نتیجه توالی یابی جهش حذف(∆F508)در اگزون 10 ژن CFTR         
شکل 4-6-1. نمونه ای از ژل SSCP در مورد اگزون 21 ژن CFTR    
شکل 4-6-2. تغییر نوکلئوتیدی)  3933T>G (S1311R در اگزون 4 ژن CFTR        
شکل 4-7. شناسایی پلی مورفیسم پلیT          
شکل 4-8. شناسایی پلی مورفیسم   M470V      
شکل5-1. پروتئین CFTR      
 شکل 5-2.تاثیر آللهای ویژه روی مقدار پروتئین CFTRدارای عملکرد            
فهرست جدولها:
جدول 2-1. انواع جهش های رایج ژن CFTR و توزیع جهانی آنها    
جدول3-1.پارامترهای  مایع منی و خون بیمارانCAVD Non          
جدول3-2.پارامترهای  مایع منی و خون بیماران  CBAVD   
جدول3-3.پارامترهای  مایع منی و خون بیماران  CUAVD   
جدول.3-4.برنامه PCR برای تکثیر اگزون های7،10،11،20،21ژنCFTR     
جدول.3-5.برنامه PCR برای تکثیر اگزون 4ژن CFTR 
جدول.3-6.شرایطPCR برای تکثیر اگزون های7،10،11،20،21،4 ژنCFTR  
جدول3-7.توالی پرایمرهای اگزونهای Hot spot      
جدول3-8. برنامه PCR جهت PCR-RFLP   
جدول.3-9.شرایطPCR برای PCR-RFLP     
جدول3-10. توالی پرایمر های اگزون 9/اینترون8 جهت تشخیص  پلی مورفیسم  پلیT  
جدول3-11.توالی پرایمر های اگزون 4 جهت تشخیص  جهش R117H     
جدول3-12. توالی پرایمر های مخصوص ARMS PCR         
جدول3-13.برنامه Multiplex برای تشخیص جهش های F508,G542X,N1303K 
جدول3-14. برنامه Single ARMS PCR برای تشخیص جهش      
جدول3-15. برنامه Single ARMS PCR برای تشخیص جهش        
جدول.3-16.شرایطPCR برای ARMS-PCR    
جدول 4-1. نحوه شناسایی جهش R117H با استفاده از روش PCR-RFLP         
جدول4-2.نتایج تکنیک ARMS PCR بیماران Non-CBAVD Obstructive Azoospermia مورد مطالعه         
جدول4-3. فرکانسهای آللی و ژنوتیپی بیماران Non-CBAVD Obstructive Azoospermia مورد مطالعه   
جدول4-4.نتایج تکنیک ARMS PCR برای بیماران CBAVD Obstructive Azoospermia      
جدول4-5.نتایج تکنیک ARMS PCR برای بیماران CUAVD Obstructive Azoospermia      
جدول4-6. فرکانسهای آللی و ژنوتیپی در بیماران CBAVD Obstructive Azoospermia    
جدول4-7. فرکانسهای آللی و ژنوتیپی در بیماران CUAVD Obstructive Azoospermia   
جدول4-8.نتایج تکنیک PCR-RFLP برای بیماران Non-CBAVD Obstructive Azoospermia          
جدول4-9.نتایج تکنیک PCR-RFLP برای بیماران CBAVD Obstructive Azoospermia       
جدول4-10.نتایج تکنیک PCR-RFLP برای بیماران CUAVD Obstructive Azoospermia          
جدول4-11.فرکانس ژنوتیپهای پلیT در بیماران CUAVDبا تکنیک  PCR-RFLP     
جدول4-12.فرکانس آللهای پلی T در بیماران CUAVDبا تکنیک  PCR-RFLP        
جدول4-13.فرکانس ژنوتیپهای پلی مورفیسم  M470V در بیمارانCUAVD  با تکنیک  PCR-RFLP 
جدول4-14.فرکانس آللهای پلی مورفیسمM470Vدربیماران CUAVD با تکنیک PCR-RFLP   
جدول4-15.نتایج تکنیک PCR-RFLP پلی مورفیسمهای پلی Tو M470Vدرافراد شاهد     
جدول4-16.فرکانس ژنوتیپهای پلیT در بیماران CUAVDبا تکنیک  PCR-RFLP     
جدول4-17.فرکانس آللهای پلیT در بیماران CUAVDبا تکنیک  PCR-RFLP         
جدول4-18.فرکانس ژنوتیپهای پلی مورفیسمM470Vدربیماران CBAVD با تکنیک  PCR-RFLP 
جدول4-19.فرکانس آللهای پلی مورفیسمM470Vدربیماران CBAVD با تکنیک PCR-RFLP  
جدول4-20.فرکانس ژنوتیپهای پلیT در بیمارانCAVD Non-با تکنیک  PCR-RFLP 
جدول4-21.فرکانس آللهای پلیT در بیمارانCAVD Non-با تکنیک  PCR-RFLP    
جدول4-22.فرکانس ژنوتیپهای پلی مورفیسمM470Vدر بیماران Non-CAVD با تکنیک  .PCR-RFLP       
جدول4-23.فرکانس آللهای  پلی مورفیسمM470V در بیماران  Non-CAVD با تکنیک  PCR-RFLP 
جدول4-24.جهش ها و پلی مورفیسم های شناخته شده در 152ژنCFTRدر بیماران مورد مطالعه